水质发光细菌高通量急性毒性测试方法团

由上海市环境科学学会、江苏省环境监测协会、浙江省环境监测协会联合组织编制的团体标准《水质发光细菌高通量急性毒性测试方法》已形成征求意见稿。按照《上海市环境科学学会团体标准管理办法》、《江苏省环境监测协会团体标准管理办法(试行)》、《浙江省环境监测协会团体标准管理办法(试行)》的有关要求，现公开征求意见。

本文件按照GB/T1.1-《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的规定起草。参考GB/T.2生活饮用水标准检验方法水样的采集与保存；GB/T分析实验室用水规格和试验方法；GB.3海洋监测规范第3部分：样品采集、贮存与运输；HJ/T91地表水和污水监测技术规范；HJ91.1污水监测技术规范；HJ/T地下水环境监测技术规范等规程编制。

本标准规定了高通量测定水质急性毒性的发光细菌法。本标准适用于测定地表水，地下水，饮用水、生活污水，工业废水及海水的发光细菌急性毒性。

方法原理：

发光细菌暴露在无毒性的水体中可以正常发光，当水体中含有环境毒物时，发光便会受到抑制，受抑制程度与毒物浓度之间有较好的正相关关系。本标准使用高通量的96孔板作为反应载体，通过生物发光检测仪测定系列稀释的环境水样(如地表水，地下水，饮用水、生活污水，工业废水及海水)与发光细菌接触一定时间后的发光强度变化，可以利用发光细菌的相对发光强度(Tt)、相对抑制率(Ht)与稀释系列浓度的曲线关系获得效应浓度(EC)、毒性当量(TEQ)、毒性单位(TU)或最低无效应稀释度(LID)来表征水样的急性毒性水平并评价毒性程度。

仪器和设备：

1.适用于96孔板的、具有顶读及生物发光检测功能的仪器。2.pH计：精确到0.1pH单位，测量范围从0到14。3.溶解氧测定仪：精确到0.1mg/L。4.盐度计：精确到0.1mg/L或0.1%。5.电子分析天平：精度为0.g。6.培养箱：15℃，在一次测试中，温度偏差不超过±1℃。7.冰箱：冷藏温度2~8℃，冷冻温度-18℃以下。8.涡旋混合器。9.平板振荡器。10.单通道移液器：μL、1mL、5mL、10mL。11.多通道移液器：μL。

样品的采集：

1.地表水、生活污水和工业废水的采集须符合HJ/T91以及HJ91.1要求的技术规范。2.地下水的采集须符合HJ/T要求的技术规范。3.饮用水的采集须符合GB/T.2要求的技术规范。4.海水样品的采集须符合GB.3要求的技术规范。

样品的保存：

采样瓶使用惰性材料制成(如聚四氟乙烯)，务必清洁、干燥。采样时，水样应该充满容器，不留空气，密封。样品保存在放有冰袋的保温箱内运送回实验室，6小时内分析。若样品不能及时分析，应在2~8℃的黑暗环境下冷藏保存，但不得超过48小时。可在-18℃以下保存长达两个月。样品的保存不添加任何化学试剂。

样品测试：

每次试验设置空白对照、参比样品对照和样品组，每个组至少两个平行。可测试的最小稀释度为1→1.25(80%样品，D=1)，作为几乎未稀释的样品，可以通过将4体积的样品与1体积的细菌悬液(例如L样品和40L细菌悬液)混合而制备，同时需要设置一个空白对照(D=1)，通过40L细菌悬液和L稀释液进行配制。其他稀释系列是由样品试验溶液和细菌悬浮液等体积混合的，白对照(D=2)每孔加入L细菌悬液和L的稀释液，参比样品对照每孔加入L细菌悬液和L的参比样品溶液，样品组每孔加入L细菌悬液和L的样品溶液(见附录B)。

参比样品对照和样品组96孔板排列方式参见附录C。在96孔板(6.10)中，使用多通道移液器(7.11)，每孔加入细菌悬液后，立刻置于测试温度下，等待30分钟后，用发光检测仪(7.1)测定发光强度，记录为I0；然后将样品或稀释后的样品迅速加入到细菌悬液中，使用平板振荡器轻轻振荡摇匀(7.9)，并置于规定的测试温度下，在接触5分钟、15分钟或30分钟时测定发光强度，分别记录为I5、I15、I30，不同微孔板的测定间隔宜在30秒以内。

结果计算与表示：

测试结果可以使用相对发光强度(Tt)、相对抑制率(Ht)，也可以计算得到效应浓度(EC)、毒性当量(TEQ)、毒性单位(TU)或最低无效应稀释度(LID)表示。

结果评价：

对于排放到自然水体中的任何废水(如生活污水、工业废水)，采用EC50值或TU值评价样品的急性毒性，EC50值越小，测试样品毒性越强；TU值越大，测试样品毒性越强。(更多详情请见附件)

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